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温故知新

热图美化

的绘图命令中，最后一行的操作抹去了之前设定的横轴标记的旋转，最后出来的图比较难看。上次我们是这么写的

p <- p + xlab("samples") + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank())

为了使横轴旋转45度，需要把这句话：

theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1))放在theme_bw()的后面。

p <- p + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1))

最后的图应该是下边样子的。

上图的测试数据，数值的分布比较均一，相差不是太大，但是Gene_4和Gene_5由于整体的值低于其它的基因，从颜色上看，不仔细看，看不出差别。

实际应用中，异常值的出现会毁掉一张热图，如下是一个例子。

data <- c(rnorm(5,mean=5), rnorm(5,mean=20), rnorm(5, mean=100), c(600,700,800,900,10000))
data <- matrix(data, ncol=5, byrow=T)
data <- as.data.frame(data)
rownames(data) <- letters[1:4]
colnames(data) <- paste("Grp", 1:5, sep="_")
data

       Grp_1      Grp_2      Grp_3      Grp_4        Grp_5
a   5.958073   5.843652   3.225465   4.886184     3.411362
b  19.630582  20.376791  20.744580  18.534027    20.638288
c 100.351299  99.849900 102.197343  98.583629    99.540488
d 600.000000 700.000000 800.000000 900.000000 10000.000000

data$ID <- rownames(data)
data

       Grp_1      Grp_2      Grp_3      Grp_4        Grp_5 ID
a   5.958073   5.843652   3.225465   4.886184     3.411362  a
b  19.630582  20.376791  20.744580  18.534027    20.638288  b
c 100.351299  99.849900 102.197343  98.583629    99.540488  c
d 600.000000 700.000000 800.000000 900.000000 10000.000000  d

data_m <- melt(data, id.vars=c("ID"))
head(data_m)

  ID variable      value
1  a    Grp_1   5.958073
2  b    Grp_1  19.630582
3  c    Grp_1 100.351299
4  d    Grp_1 600.000000
5  a    Grp_2   5.843652
6  b    Grp_2  20.376791

p <- ggplot(data_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab("samples") + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank())  + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) + theme(legend.position="top") +  geom_tile(aes(fill=value)) + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")
p
dev.off()

输出的结果是这个样子的

图中只有右上角可以看到红色，其他地方就没了颜色的差异。这通常不是我们想要的。为了更好的可视化效果，需要对数据做些预处理，主要有 对数转换，Z-score转换，抹去异常值，非线性颜色等方式。

对数转换

为了方便描述，假设下面的数据是基因表达数据，4个基因 (a, b, c, d)和5个样品 (Grp_1, Grp_2, Grp_3, Grp_4)，矩阵中的值代表基因表达FPKM值。

data <- c(rnorm(5,mean=5), rnorm(5,mean=20), rnorm(5, mean=100), c(600,700,800,900,10000))
data <- matrix(data, ncol=5, byrow=T)
data <- as.data.frame(data)
rownames(data) <- letters[1:4]
colnames(data) <- paste("Grp", 1:5, sep="_")
data

    Grp_1      Grp_2      Grp_3      Grp_4        Grp_5
a   6.61047  20.946720 100.133106 600.000000     5.267921
b  20.80792  99.865962 700.000000   3.737228    19.289715
c 100.06930 800.000000   6.252753  21.464081    98.607518
d 900.00000   3.362886  20.334078 101.117728 10000.000000

# 对数转换
# +1是为了防止对0取对数；是加1还是加个更小的值取决于数据的分布。
# 加的值一般认为是检测的低阈值，低于这个值的数字之间的差异可以忽略。
data_log <- log2(data+1)
data_log

    Grp_1    Grp_2    Grp_3    Grp_4     Grp_5
a 2.927986 4.455933 6.660112 9.231221  2.647987
b 4.446780 6.656296 9.453271 2.244043  4.342677
c 6.659201 9.645658 2.858529 4.489548  6.638183
d 9.815383 2.125283 4.415088 6.674090 13.287857

data_log$ID = rownames(data_log)
data_log_m = melt(data_log, id.vars=c("ID"))

p <- ggplot(data_log_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab("samples") + ylab(NULL) + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank()) + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) + theme(legend.position="top") +  geom_tile(aes(fill=value)) + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")
ggsave(p, filename="heatmap_log.pdf", width=8, height=12, units=c("cm"),colormodel="srgb")

对数转换后的数据，看起来就清晰的多了。而且对数转换后，数据还保留着之前的变化趋势，不只是基因在不同样品之间的表达可比 (同一行的不同列)，不同基因在同一样品的值也可比 (同一列的不同行) (不同基因之间比较表达值存在理论上的问题，即便是按照长度标准化之后的FPKM也不代表基因之间是完全可比的)。

Z-score转换

Z-score又称为标准分数，是一组数中的每个数减去这一组数的平均值再除以这一组数的标准差，代表的是原始分数距离原始平均值的距离，以标准差为单位。可以对不同分布的各原始分数进行比较，用来反映数据的相对变化趋势，而非绝对变化量。

data_ori <- "Grp_1;Grp_2;Grp_3;Grp_4;Grp_5
a;6.6;20.9;100.1;600.0;5.2
b;20.8;99.8;700.0;3.7;19.2
c;100.0;800.0;6.2;21.4;98.6
d;900;3.3;20.3;101.1;10000"

data <- read.table(text=data_ori, header=T, row.names=1, sep=";", quote="")

# 去掉方差为0的行，也就是值全都一致的行
data <- data[apply(data,1,var)!=0,]

data

  Grp_1 Grp_2 Grp_3 Grp_4   Grp_5
a   6.6  20.9 100.1 600.0     5.2
b  20.8  99.8 700.0   3.7    19.2
c 100.0 800.0   6.2  21.4    98.6
d 900.0   3.3  20.3 101.1 10000.0

# 标准化数据，获得Z-score，并转换为data.frame
data_scale <- as.data.frame(t(apply(data,1,scale)))

# 重命名列
colnames(data_scale) <- colnames(data)
data_scale

       Grp_1      Grp_2      Grp_3      Grp_4      Grp_5
a -0.5456953 -0.4899405 -0.1811446  1.7679341 -0.5511538
b -0.4940465 -0.2301542  1.7747592 -0.5511674 -0.4993911
c -0.3139042  1.7740182 -0.5936858 -0.5483481 -0.3180801
d -0.2983707 -0.5033986 -0.4995116 -0.4810369  1.7823177

data_scale$ID = rownames(data_scale)
data_scale_m = melt(data_scale, id.vars=c("ID"))

p <- ggplot(data_scale_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab("samples") + ylab(NULL) + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank()) + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) +  geom_tile(aes(fill=value)) + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")
ggsave(p, filename="heatmap_scale.pdf", width=8, height=12, units=c("cm"),colormodel="srgb")

Z-score转换后，颜色分布也相对均一了，每个基因在不同样品之间的表达的高低一目了然。但是不同基因之间就完全不可比了。

抹去异常值

粗暴一点，假设检测饱和度为100，大于100的值都视为100对待。

data_ori <- "Grp_1;Grp_2;Grp_3;Grp_4;Grp_5
a;6.6;20.9;100.1;600.0;5.2
b;20.8;99.8;700.0;3.7;19.2
c;100.0;800.0;6.2;21.4;98.6
d;900;3.3;20.3;101.1;10000"

data <- read.table(text=data_ori, header=T, row.names=1, sep=";", quote="")

data[data>100] <- 100
data

  Grp_1 Grp_2 Grp_3 Grp_4 Grp_5
a   6.6  20.9 100.0 100.0   5.2
b  20.8  99.8 100.0   3.7  19.2
c 100.0 100.0   6.2  21.4  98.6
d 100.0   3.3  20.3 100.0 100.0

data$ID = rownames(data)
data_m = melt(data, id.vars=c("ID"))

p <- ggplot(data_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab("samples") + ylab(NULL) + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank()) + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) +  geom_tile(aes(fill=value)) + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")
ggsave(p, filename="heatmap_nooutlier.pdf", width=8, height=12, units=c("cm"),colormodel="srgb")

虽然损失了一部分信息，但整体模式还是出来了。只是在选择异常值标准时需要根据实际确认。

非线性颜色

正常来讲，颜色的赋予在最小值到最大值之间是均匀分布的。非线性颜色则是对数据比较小但密集的地方赋予更多颜色，数据大但分布散的地方赋予更少颜色，这样既能加大区分度，又最小的影响原始数值。通常可以根据数据模式，手动设置颜色区间。为了方便自动化处理，我一般选择用四分位数的方式设置颜色区间。

data_ori <- "Grp_1;Grp_2;Grp_3;Grp_4;Grp_5
a;6.6;20.9;100.1;600.0;5.2
b;20.8;99.8;700.0;3.7;19.2
c;100.0;800.0;6.2;21.4;98.6
d;900;3.3;20.3;101.1;10000"

data <- read.table(text=data_ori, header=T, row.names=1, sep=";", quote="")

data

  Grp_1 Grp_2 Grp_3 Grp_4   Grp_5
a   6.6  20.9 100.1 600.0     5.2
b  20.8  99.8 700.0   3.7    19.2
c 100.0 800.0   6.2  21.4    98.6
d 900.0   3.3  20.3 101.1 10000.0

data$ID = rownames(data)
data_m = melt(data, id.vars=c("ID"))
# 获取数据的最大、最小、第一四分位数、中位数、第三四分位数
summary_v <- summary(data_m$value)
summary_v

    Min.  1st Qu.   Median     Mean  3rd Qu.     Max.
    3.30    16.05    60.00   681.40   225.80 10000.00

# 在最小值和第一四分位数之间划出6个区间，第一四分位数和中位数之间划出6个区间，中位数和第三四分位数之间划出5个区间，最后的数划出5个区间
break_v <- unique(c(seq(summary_v[1]*0.95,summary_v[2],length=6),seq(summary_v[2],summary_v[3],length=6),seq(summary_v[3],summary_v[5],length=5),seq(summary_v[5],summary_v[6]*1.05,length=5)))
break_v

 [1]     3.135     5.718     8.301    10.884    13.467    16.050    24.840
 [8]    33.630    42.420    51.210    60.000   101.450   142.900   184.350
[15]   225.800  2794.350  5362.900  7931.450 10500.000

# 安照设定的区间分割数据
# 原始数据替换为了其所在的区间的数值
data_m$value <- cut(data_m$value, breaks=break_v,labels=break_v[2:length(break_v)])
break_v=unique(data_m$value)

data_m

   ID variable   value
1   a    Grp_1   8.301
2   b    Grp_1   24.84
3   c    Grp_1  101.45
4   d    Grp_1 2794.35
5   a    Grp_2   24.84
6   b    Grp_2  101.45
7   c    Grp_2 2794.35
8   d    Grp_2   5.718
9   a    Grp_3  101.45
10  b    Grp_3 2794.35
11  c    Grp_3   8.301
12  d    Grp_3   24.84
13  a    Grp_4 2794.35
14  b    Grp_4   5.718
15  c    Grp_4   24.84
16  d    Grp_4  101.45
17  a    Grp_5   5.718
18  b    Grp_5   24.84
19  c    Grp_5  101.45
20  d    Grp_5   10500

# 虽然看上去还是数值，但已经不是数字类型了
# 而是不同的因子了，这样就可以对不同的因子赋予不同的颜色了
> is.numeric(data_m$value)
[1] FALSE
> is.factor(data_m$value)
[1] TRUE

break_v

#[1] 8.301   24.84   101.45  2794.35 5.718   10500
#18 Levels: 5.718 8.301 10.884 13.467 16.05 24.84 33.63 42.42 51.21 … 10500

# 产生对应数目的颜色
gradientC=c('green','yellow','red')
col <- colorRampPalette(gradientC)(length(break_v))
col

#[1] "#00FF00" "#66FF00" "#CCFF00" "#FFCB00" "#FF6500" "#FF0000"

p <- ggplot(data_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab("samples") + ylab(NULL) + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank()) + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) +  geom_tile(aes(fill=value))

# 与上面不同的地方，使用的是scale_fill_manual逐个赋值
p <- p + scale_fill_manual(values=col)
ggsave(p, filename="heatmap_nonlinear.pdf", width=8, height=12, units=c("cm"),colormodel="srgb")

调整行的顺序或列

如果想保持图中每一行的顺序与输入的数据框一致，需要设置因子的水平。这也是中调整图例或横纵轴字符顺序的常用方式。

data_rowname <- rownames(data)
data_rowname <- as.vector(rownames(data))
data_rownames <- rev(data_rowname)
data_log_m$ID <- factor(data_log_m$ID, levels=data_rownames, ordered=T)
p <- ggplot(data_log_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab(NULL) + ylab(NULL) + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank()) + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) + theme(legend.position="top") +  geom_tile(aes(fill=value)) + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")
ggsave(p, filename="heatmap_log.pdf", width=8, height=12, units=c("cm"),colormodel="srgb")

基于的heatmap绘制到现在就差不多了，而关于数据可视化还有很多值得探索，还请留意后续分享✌

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