read_counts, FPKM, TPM定义理解参考：

http://www.360doc.com/content/18/0112/02/50153987_721216719.shtml

在RNA-Seq的分析中，对基因或者转录本的reads count数目进行标准化是一个很重要的步骤，因为落在一个基因区域内的read数目取决于基因长度和测序深度。基因越长read数目越多，测序深度越高，则一个基因对应的read数目也相对越多。所以必须要标准化，而标准化的两个关键因素就是基因长度与测序深度。

FPKM先对测序深度进行标准化，然后再对基因长度进行标准化。

TPM先对再对基因长度进行标准化，然后测序深度进行标准化。

不管是计算FPKM、RPKM，还是计算TPM，我们都要先得到一个ReadCount的矩阵（行为基因，列为样本）。在计算FPKM和RPKM时，都是先按列（也就是这个样本的总read数）进行标化，之后再对对个基因的长度进行标准化。而TPM是先对基因长度进行标准化，之后再对列（这个时候就不再是这个样本的总read数了）进行标化。这样使得最终的TPM矩阵的每列都相同（列和都等于1），也就是说每个样本中的TPM的和都是一样的。这样就会使得我们更容易去比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。而RPKM/FPKM由于最终的表达值矩阵的列和不同，故而不能直接比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。

#载入数据

mycounts<-read.csv("2020武汉加油.csv")
head(mycounts)
rownames(mycounts)<-mycounts[,1]
mycounts<-mycounts[,-1]
head(mycounts)

#TPM计算

kb <- mycounts$Length / 1000
kb
countdata <- mycounts[,1:9]
rpk <- countdata / kb
rpk
tpm <- t(t(rpk)/colSums(rpk) * 1000000)
head(tpm)
write.table(tpm,file="2020武汉加油_tpm.xls",sep="\t",quote=F)

#FPKM计算

fpkm <- t(t(rpk)/colSums(countdata) * 10^9)
head(fpkm)
write.table(fpkm,file="2020武汉加油_fpkm.xls",sep="\t",quote=F)

#FPKM转化为TPM

fpkm_to_tpm = t(t(fpkm)/colSums(fpkm))*10^6
head(fpkm_to_tpm)
当然，已知所有基因的FPKM情况下，可以通过上述公式直接在excel里计算相应基因的TPM值。

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